核移植
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所謂細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過精子穿透等有性過程即無性繁殖即可被激活、分裂并發(fā)育成新個(gè)體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。以供體核的來源不同可分為胚細(xì)胞核移植與體細(xì)胞核移植兩種。
【哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)研究進(jìn)展】
哺乳動(dòng)物核移植是將外源的一個(gè)細(xì)胞核與一個(gè)去核卵母細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生遺傳上同質(zhì)的動(dòng)物的技術(shù)。它在動(dòng)物育種、制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因治療及器官移植等方面具有重大的作用。
具體方法
『1 供體核的獲得』
供體核可以是早期胚胎細(xì)胞、胚胎千細(xì)胞和體細(xì)胞。早期都采用合子核到64細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞核質(zhì)體分裂球作供體細(xì)胞核，80年代開始，隨著胚胎干細(xì)胞（embryo stem cells，ES)的建立和對其研究的深入，人們對胚胎干細(xì)胞在核移植方面的應(yīng)用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。Teruhiko Wakayama等利用ES系克隆小鼠，結(jié)果有29％的重構(gòu)胚在體外能發(fā)育到囊胚階段，移植給假孕小鼠有8％胚胎附植并產(chǎn)下小鼠。1997年Dolly羊的出現(xiàn)，開始了體細(xì)胞的核移植，并發(fā)展很快。
1.1 胚細(xì)胞
用0.2％鏈霉蛋白酶預(yù)處理胚胎，溶去胚胎的膠膜及透明帶，分離出單個(gè)卵裂球。消化透明帶的時(shí)間是影響卵裂球質(zhì)量的重要因素，作用時(shí)間短，透明帶不能充分消化，卵裂球不易獲得；作用時(shí)間長，則影響到卵質(zhì)膜，容易破裂，在操作時(shí)容易失敗。因此，在分離卵裂球時(shí)應(yīng)在解剖鏡下監(jiān)視透明帶的消化過程，當(dāng)透明帶變薄，膨脹適度時(shí)就應(yīng)移出，再用適當(dāng)口徑的吸管吹打使之分離。另外，蘇格蘭學(xué)者Campbell等顯微分離胚盤細(xì)胞并在體外進(jìn)行缺血饑餓傳代培養(yǎng)，誘使細(xì)胞處于“靜止”狀態(tài)，以便調(diào)整染色體結(jié)構(gòu)，從而有助于核的重組與發(fā)育，他們使用這種方法建立了綿羊TNT4細(xì)胞系，該細(xì)胞形態(tài)類似于胚胎干細(xì)胞，但更扁平、上皮化。
1.2 體細(xì)胞
最早用青蛙腸粘膜上皮細(xì)胞獲得了后代。Wilmut等用綿羊乳腺細(xì)胞獲得Dolly羊。美國夏威夷大學(xué)Ryuzo Yanagimachi教授領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)國際科研小組于1998年以小鼠卵丘細(xì)胞為核供體，采用吸移管注入，利用機(jī)械和化學(xué)激活方式進(jìn)行細(xì)胞的融合，成功培育三代克隆小鼠。對小鼠、牛體細(xì)胞移植的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)休眠(G0)的顆粒細(xì)胞核與去核MⅡ期卵母細(xì)胞構(gòu)成的體細(xì)胞重構(gòu)胚，其發(fā)育率及產(chǎn)生克隆后代的能力遠(yuǎn)高于其它類型的休眠體細(xì)胞，這可能緣于顆粒細(xì)胞上存在著與卵母細(xì)胞緊密聯(lián)系的胞質(zhì)微絨毛橋的緣故，它或許有助于供體核同受體核胞質(zhì)因子的交換。
『2 受體細(xì)胞的獲得及其去核』
作為細(xì)胞核移植的受體細(xì)胞主要有三類：去核的卵母細(xì)胞、受精卵和2-細(xì)胞胚胎，其中卵母細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛。近來有人用兩個(gè)去核卵母細(xì)胞融合后產(chǎn)生的胞質(zhì)作為受體進(jìn)行各代核移植，以增加核移植胚胎的細(xì)胞數(shù)和提高繼代移植效率。研究證明，體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞核移植成功率不如體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，其原因可能是卵母細(xì)胞在體外成熟過程中，需要合成一些蛋白質(zhì)來完成第一次減數(shù)分裂，體外成熟的一些卵母細(xì)胞其活動(dòng)有可能受到抑制。
2.1 卵母細(xì)胞的去核方法
2.1.1 盲吸法 用微細(xì)玻璃管在第一極體下盲吸，吸除第一極體及處于分裂中期的染色體和周圍的部分細(xì)胞質(zhì)，但該方法成功率低。為提高去核率，利用Hoechst33342染料對染色質(zhì)的特異性染色作用，在熒光顯微鏡下去核后判斷去核是否完成，去核準(zhǔn)確率大為提高。Stice等用Hoechst33342(1μg/ml)染色，在紫外線下照射的時(shí)間控制在10s以內(nèi)，未觀察到對胚胎發(fā)育的負(fù)面影響。
2.1.2 半卵法 用微細(xì)玻管針在透明帶上做一切口后，用微細(xì)玻管吸去一半染色質(zhì)至另一半空透明帶內(nèi)，即將卵母細(xì)胞分為兩半，然后用Hoechst33342染色，確定不含染色體的一半為細(xì)胞質(zhì)受體。其操作方法如下，將卵母細(xì)胞移入35mm含有mPBSA(磷酸緩沖液，其中有D-葡萄糖1OOOmg/l、丙酮酸36mg/l、0.4％牛血清白蛋白、1％青霉素和鏈霉素10000μg/ml)的皮氏培養(yǎng)皿中進(jìn)行顯微操作，首先分兩步進(jìn)行分割透明帶，即先在透明帶上切一小口，然后用另一切割針擴(kuò)大切口，從而分割透明帶。透明帶被切除后轉(zhuǎn)移到含有mPBSA+5μg/ml細(xì)胞松弛素B的35mm的皮氏培養(yǎng)皿中作用3一5min，然后用固定針(內(nèi)徑為透明帶的l/5一1/3，外徑接近透明帶的直徑)固定，分割針進(jìn)入透明帶的隙口中并將該針固定在靠著透明帶的地方，緩慢吸取卵母細(xì)胞液，當(dāng)分割針中吸取了一半卵母細(xì)胞液時(shí)，這時(shí)將該針從卵黃隙中移出，并靠著透明帶切割邊緣輕微地擦過以達(dá)到完全的分割，將其針中的卵母細(xì)胞液移入準(zhǔn)備好了的空透明帶中，并用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察不發(fā)熒光的作為受體卵母細(xì)胞。
2.1.3離心去核 Tatham等以150OOg、2min離心牛卵母細(xì)胞，用鏈霉蛋白酶去除卵母細(xì)胞透明帶(ZP)，經(jīng)滲透壓梯度離心，MⅡ期紡錘體可從大多數(shù)卵母細(xì)胞中分開，把無透明帶的去核胞質(zhì)作核移植的供質(zhì)，同分裂球聚集經(jīng)電融合成核移植胚，最后放入藻酸鈉假透明帶中，能在體外卵裂和發(fā)育，但其效果還有待于進(jìn)一步研究。
2.1.4 末Ⅱ期去核法 Bordignon等提出把卵母細(xì)胞先激活使之處于末Ⅱ期，在排出第二極體時(shí)吸出第二極體及周圍的少量細(xì)胞質(zhì)，從而達(dá)到去核。這種方法避免使用DNA染料和經(jīng)紫外線照射來定位染色體，并且去除的細(xì)胞質(zhì)相對較少。該去核方法比MⅡ期去核的成功率有顯著提高，但這種細(xì)胞質(zhì)容易老化，是否能對基因組完全重排序，順利完成后期發(fā)育，有待于研究。
2.2 去核時(shí)間與去核成功率
多數(shù)研究者在多數(shù)卵母細(xì)胞出現(xiàn)第一極體的成熟時(shí)期去核，去核時(shí)間，體內(nèi)成熟在發(fā)情開始后48h，體外成熟22－24h。卵母細(xì)胞去核程序與重構(gòu)胚中再程序化狀況密切相關(guān)，去核率越高，其克隆胚最終發(fā)育成正常胚的可能性越大。去核率的高低與卵母細(xì)胞所處的成熟時(shí)期以及所采用的方法密切相關(guān)。以前的核移植研究均采用未激活的卵母細(xì)胞作為核受體，并認(rèn)為激活后卵母細(xì)胞的重排能力會(huì)下降，影響核移植的效率。但Ushijima，等和Terlovw等；研究表明，激活后的卵母細(xì)胞作為核供體時(shí)，重構(gòu)胚融合和發(fā)育能力均優(yōu)于融合激活同時(shí)進(jìn)行的效果。
2.3 胞質(zhì)容士與重構(gòu)胚的發(fā)育潛力
有人對核反比例與重構(gòu)胚發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明，卵母細(xì)胞去除的胞質(zhì)量與預(yù)期供核體積大小相當(dāng)時(shí)，可以為細(xì)胞周期的相互作用創(chuàng)造最好的條件，而去除太少或太多并不理想。基于去除細(xì)胞質(zhì)的量與去核率關(guān)系密切，因此，在保證有較高的去核情況下。去除的胞質(zhì)應(yīng)盡量少。
『3 核卵重組』
在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細(xì)胞的間隙中，根據(jù)移人的部位不同，可分為帶下移植和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。那些卵裂球很難分離的胚胎可以在添有鈣和鎂-游離的磷酸緩沖鹽溶液的mPBSA中孵育30－6Omin使細(xì)胞分裂停止。但孵育時(shí)間超過6Omin，細(xì)胞膜的完整性將遭到破壞，操作過程中細(xì)胞的溶化率將增加。在移植針移開后，對移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與半卵母細(xì)胞接觸。
『4 細(xì)胞融合/激活』
4.1 融合與激活
由于微吸管破壞了卵膜和一部分細(xì)胞質(zhì)，若直接移植，成功率很低，故需對重組胚融合，其采用的方法有仙臺病毒法、電融合法，后者更常用。電融合時(shí)選擇的電壓范圍和脈沖頻率取決于融合箱中兩個(gè)電極的距離。融合箱的距離由2OOμm，到幾毫米，因此在脈沖是200μsec倍數(shù)且能傳導(dǎo)lKV/cm的直流電基本滿足要求。對小鼠、家兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行胚胎核移植時(shí)還發(fā)現(xiàn)，受體卵母細(xì)胞在重構(gòu)胚電融合時(shí)被激活的狀態(tài)與重購胚的發(fā)育率密切相關(guān)，脈沖強(qiáng)度為2.0-3.6K/cm、融合時(shí)間為60-2OOμsec是適宜范圍。若脈沖過強(qiáng)，融合時(shí)間過長，對重構(gòu)胚的進(jìn)一步發(fā)育極為不利。Kono等提出針對不同時(shí)期的供體核采取不同激活程序得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①對于G2期和M期的供體核即4倍DNA供體，在融合時(shí)可采用不引起卵母細(xì)胞活化的仙臺病毒或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射，然后再給予激活處理，使一半DNA以極體方式排出，隨后形成原核及正常2倍體細(xì)胞，應(yīng)用此法已產(chǎn)生了正常的小鼠；②對于G0、G1及S期供體核，可采用融合前激活和融合時(shí)激活兩種方式，以防止供體核形成中期板而導(dǎo)致染色體的不正常。Szollosi用小鼠胸腺細(xì)胞作核移植實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有成熟的去核卵母細(xì)胞被激活前或激活后3Omin進(jìn)行融合，移入的供體細(xì)胞核才發(fā)生降解，并重新聚合形成新核膜，若超過3Omin再觸合，雖然移入的供體核才發(fā)生降解，這可能會(huì)使供體染色質(zhì)與受體細(xì)胞質(zhì)諸因子的有效互作受到抑制，從而使再程序化過程受阻。Wakayama等人利用受體卵母細(xì)胞化學(xué)激活和重構(gòu)胚化學(xué)融合的方法，也在小鼠體細(xì)胞克隆和再克隆的研究中取得了理想的結(jié)果。
對兔卵電融合完成后，卵母細(xì)胞也因電刺激受到激活從而開始新的編程和發(fā)育，但對小鼠、大鼠和牛等還需進(jìn)一步充分的激活才能獲得發(fā)育。其方法有化學(xué)和電激活兩種，化學(xué)激劑有7％乙醇、Ionomycin(離子霉素)、鈣離子載體A23187，采用Ionomycin激活后再用6-DMAP處理3h，可避免出現(xiàn)PCC(早熟染色體凝集)，并增加羊重構(gòu)胚的發(fā)育率及出生率。
4.2 融合率與細(xì)胞期
Prather等(1989)研究結(jié)果表明，融合率與細(xì)胞期無顯著差異，說明卵裂球的體積變小對融合率并無顯著的影響，張涌(1992)在小鼠研究中也得出類似的結(jié)果。Robal等也認(rèn)為，融合率與受體卵母細(xì)胞的時(shí)齡有關(guān)，并且還與核供體接觸的面積和接觸的緊密程度有關(guān)，而與移入的卵裂球處于什么時(shí)期無關(guān)，但是重構(gòu)胚的發(fā)育率與供體胚的細(xì)胞期是有關(guān)的。
4.3 溫度、卵母細(xì)胞成熟時(shí)間對卵母細(xì)胞激活的影響
隨著卵母細(xì)胞在體外成熟時(shí)間的延長，進(jìn)而老化，成熟促進(jìn)因子（MPF）下降，易激活。體外成熟老化的牛卵母細(xì)胞對溫度誘導(dǎo)激活高度繁感，在一定的溫度誘導(dǎo)激活下，卵母細(xì)胞染色質(zhì)聚縮，“自動(dòng)去核”的頻率高。幼稚卵母細(xì)胞不容易在室溫下激活，即使激活也不穩(wěn)定，可能逆轉(zhuǎn)到中期。
『5 重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植』
重構(gòu)胚需一定時(shí)間的培養(yǎng)，方可移植到受體，家兔和豬重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)24h以內(nèi)，就可通過非手術(shù)移植，而羊和牛重構(gòu)胚所需培養(yǎng)時(shí)間較長，一般發(fā)育到囊胚或?？芭邥r(shí)移植。培養(yǎng)的方法是可將電融合的重構(gòu)胚放大1O％FCS的RD微滴內(nèi)培養(yǎng)，也可將顯微操作的胚胎移入同種或異種的輸卵管中進(jìn)行培養(yǎng)，幾天后沖洗輸卵管，回收重構(gòu)胚。后者的實(shí)驗(yàn)方法如下，先用瓊脂和0.9％NaCI制成1.0％和1.2％瓊脂糖，將1.0％的瓊脂倒入35mm的皮氏培養(yǎng)皿中，當(dāng)溫度為37℃時(shí)將胚胎移入瓊脂塊中。應(yīng)用瓊脂切割針吸取一氣泡和mPBSA+20％新生犢牛血清，然后吸取含有瓊脂的胚胎，該針在室溫下保持幾秒鐘后將其放入MPBSA+20％新生犢牛血清的皮氏培養(yǎng)皿中。當(dāng)1.2％的瓊脂溫度達(dá)到37℃時(shí)，采用同上的方法在瓊脂糖中洗滌幾次，然后組成雙層瓊脂并采用手術(shù)移植到輸卵管中。在體外進(jìn)行重構(gòu)胚的培養(yǎng)時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)?a href="/index.php?title=%E5%9F%B9%E5%85%BB%E6%B6%B2&action=edit&redlink=1" class="new" title="培養(yǎng)液（尚未撰寫）" rel="nofollow">培養(yǎng)液非常重要。重構(gòu)胚的移植與胚胎移植的方法基本一樣，即根據(jù)受體動(dòng)物的不同可分為手術(shù)移植和非手術(shù)移植。
『6 結(jié) 語』
到目前為止，雖然核移植技術(shù)的發(fā)展較快，然而該技術(shù)還存在許多問題，如核移植成功率普遍比較低、重構(gòu)胚的發(fā)育率低、畸形胚的比率高。體外培養(yǎng)的時(shí)間過長或培養(yǎng)液的成份可能導(dǎo)致移植胚的流產(chǎn)以及出生后的仔畜很快死亡。基因重組編程的機(jī)制尚不清楚，其中MPF、NEBD(核膜破裂)和PCC在基因組重編過程的作用還需闡明。基因印記對核移植重新編程的影響以及基因印記與動(dòng)物克隆技術(shù)的成功及不足有何關(guān)系，還不清楚。
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