基因診斷與性病/PCR實驗中常見問題對策

跳轉(zhuǎn)到：導航, 搜索

基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因擴增技術(shù)（PCR）
  - PCR的基本原理和基本程序
  - PCR的特點
  - PCR方法
  - PCR反應的基本條件及其對PCR的影響
  - PCR標本的制備
  - PCR實驗中常見問題對策
  - PCR擴增產(chǎn)物的分析法

所有實驗結(jié)果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。

（一）假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA 聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關以及PCR系統(tǒng)欠妥當；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實驗中出現(xiàn)假陰性失敗時，首先在原來擴增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。

（二）假陽性：PCR結(jié)果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統(tǒng)中所擴增的產(chǎn)物是真實的。因為PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現(xiàn)假陽性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。