基因擴增
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基因擴增(gene amplification)
細胞內選擇性復制DNA, 產生大量的拷貝。如兩棲類卵母細胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數量擴增到1000多倍?；驍U增是通過形成幾千個核進行的，每個核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母細胞中的這些rRNA基因的拷貝數幾乎達到50萬個，而在相同生物的其它類型細胞中，這些rRNA基因的拷貝數只有幾百個。卵母細胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細胞在受精后的發(fā)育過程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。
至于卵母細胞中rRNA基因擴增的機制，有人認為可能是通過從染色體上分離出來的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是第一個含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過滾環(huán)復制(rolling circle replication)的方式進行復制，因而能夠產生大量的rRNA基因。
為一特異蛋白質編碼的基因的拷貝數選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。在自然條件下，基因擴增是通過從染色體切除基因的重復序列再在質粒中進行染色體外復制或通過將核糖體RNA的全部重復序列生成RNA轉錄物再轉錄生成原來DNA分子的額外拷貝而實現的。在實驗室已建立了不等交換、從裂解細胞提取DNA或經過滾環(huán)復制（rolling circle replication）生成染色體外序列進行人工基因擴增。例如，在非洲爪蟾的卵母細胞中原有rRNA基因（rDNA）約200個拷貝，在減數分裂Ⅰ的粗線期，這個基因開始迅速復制，到雙線期它的拷貝數約為200萬個，擴增近4000倍，可用于合成10的12次方個核糖體，以滿足卵裂期和胚胎期合成大量蛋白質的需要。在果蠅中也發(fā)現了基因擴增現象。 在卵巢成熟之前，卵巢顆粒細胞中產生卵殼蛋白的基因被擴增。果蠅中的卵原細胞，經4次分裂產生16個細胞，其中一個是卵母細胞（oocyte），將發(fā)育成為卵細胞，其他15個是營養(yǎng)細胞（nurse cell），它們?yōu)槁鸭毎男纬商峁┐罅康牡鞍踪|及其他大分子物質，營養(yǎng)細胞之所以能夠產生大量的營養(yǎng)物質，是因為它們在形成的過程中發(fā)生了多次特殊的DNA復制，卵殼蛋白等基因拷貝數顯著增加。
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍（圖4）,這些經合成產生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經25-35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106 倍。
PCR：聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用 PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。
PCR是在體外由酶促合成特異DNA片段的一種新方法。在反應液中含有模板DNA、人工合成的目的片段的5′端和3′端PCR引物、合成DNA的四種脫氧核苷酸底物（dNTP）、一種耐熱的DNA聚合酶（Taq酶），以及含各種離子的緩沖液。此反應體系由高溫變性、低溫復性及適溫延伸等步驟共同組成一個周期，然后反復循環(huán)進行，使目的DNA片段得以迅速擴增。其主要步驟是，待擴增的模板DNA在94℃高溫下解鏈成為單鏈DNA；低溫復性時人工合成的兩個寡聚核苷酸引物分別與目的片段兩條鏈的兩端互補結合；在72℃時Taq酶可將dNTP從引物3′端開始摻入，沿模板DNA5′→3′方向延伸，合成一條新的互補鏈。由于每一周期所產生的新DNA鏈均能成為下一循環(huán)的模板，所以PCR產物以指數方式增加，經過25~30個周期后，一般可擴增至106~107。PCR技術由于有操作簡便、省時間、特異性及敏感性均較高等特點，所以一經問世，就得到了廣泛的應用，許多條件較差的實驗室，也得以開展分子生物學研究，故可看作是分子生物學技術的一次革命。在PCR反應的各種成分中，模板DNA和引物是兩個重要因素，雖然PCR敏感性很高，可以檢測微量DNA的用量，以不低于0.1μg為宜。模板DNA的純度要求不是很嚴格，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶及Taq酶抑制劑。引物是決定PCR結果的關鍵，引物長度以15~30個堿基為宜；（G+C）約占總堿基中的50%；兩個引物之間不應發(fā)生互補；應盡量減少重復的堿基，特別是在3′端。PCR可用于擴增DNA或RNA。在擴增RNA時必須先用反轉錄酶合成cDNA第一鏈，然后進行PCT擴增，這種方法稱為逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）。目前PCR技術在腫瘤研究中也得到廣泛的應用。例如從腫瘤細胞提取基因組DNA然后用設計好的對某個基因特異的OCR引物，如p53基因第5~8外顯子的引物，進行PCR擴增，然后用單鏈DNA構型多態(tài)性（SSCP）分析技術或直接DNA測序技術，研究p53基因的點突變。RT-PCR技術廣泛應用于檢測某個癌基因、抑癌基因或其他腫瘤相關基因的過度表達或低表達。
PCR技術基本原理
PCR技術的基本原理 類似于DNA的 天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。
PCR技術簡史
PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。
PCR的實現
1985年國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發(fā)生模板和引物之 間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫(yī)學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現使PCR廣泛的被應用。
PCR的反應動力學
PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大多數情 況下，平臺期的到來是不可避免的。
PCR擴增產物
可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的，3’端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結合 時，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的 “短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加，而“長產物片段”則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。
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