臨床生物化學(xué)/比色法與分光亮度法
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在20世紀(jì)上半個(gè)世紀(jì)華勃儀得到研究實(shí)驗(yàn)室廣泛的應(yīng)用，并在酶學(xué)上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術(shù)要求高而且靈敏度低。臨床常規(guī)中很少使用。多使用簡(jiǎn)單易行的比色法測(cè)酶活性。在上半個(gè)世紀(jì)建立了一些適用于常規(guī)工作的測(cè)酶活性濃度的方法，如測(cè)定淀粉酶的Somogyi法，堿性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時(shí)間后停止酶反應(yīng)，加入各種化學(xué)試劑與產(chǎn)物或基質(zhì)反應(yīng)呈色，用比色計(jì)在可見光處比色，同時(shí)將被測(cè)物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較后計(jì)算出在此段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物消耗量，從而求得反應(yīng)速率v。
比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因?yàn)榉止夤舛确ㄓ幸韵聨讉€(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：一是測(cè)定范圍不只局限在可見光，還可擴(kuò)展到紫外和紅外部分。這就為擴(kuò)大測(cè)定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應(yīng)就可直接測(cè)定產(chǎn)物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應(yīng)A－＞B＋C，A、B、C三種物質(zhì)用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。
圖17-1 A、B、C三種物質(zhì)的吸收曲線
可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無(wú)吸光度變化因此無(wú)需停止酶反應(yīng)，只要在560nm處測(cè)定吸光度變化就很容易計(jì)算出C的變化速度，而且C物質(zhì)比A、B二物質(zhì)有更高的吸收峰，即靈敏度最高。
這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測(cè)酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無(wú)吸光性。因此建立了一類和原來(lái)比色法截然不同方法。不需停止酶反應(yīng)，在340nm根據(jù)吸光度變化，就可觀察到酶反應(yīng)變化全過程。
第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不需要如比色法那樣，作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，因?yàn)?a href="/w/%E5%88%86%E5%85%89%E5%85%89%E5%BA%A6%E8%AE%A1" title="分光光度計(jì)">分光光度計(jì)使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質(zhì)的吸光度為常數(shù)，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據(jù)此值從吸光度△A/△T不難計(jì)算出酶催化反應(yīng)速度v。
分光光度計(jì)的這些簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)使它在近年來(lái)已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點(diǎn)是需要精確帶恒溫裝置的分光光度計(jì)，在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)尚難推廣。
分光光度法的技術(shù)多樣化。設(shè)計(jì)得當(dāng)可用于各種酶的測(cè)定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化還原物質(zhì)特性。
除了前述的NAD(P)H系統(tǒng)可用于脫氫酶測(cè)定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來(lái)測(cè)定各種含這二個(gè)輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強(qiáng)吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細(xì)胞色素還原型在可見光有一個(gè)非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質(zhì)主要用于氧化還原酶的測(cè)定。
科學(xué)家還設(shè)計(jì)出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法測(cè)定。例如合成了很多對(duì)硝基酚的衍生物，用于各種水解酶的測(cè)定。堿性磷酸酶底物磷酸對(duì)硝基酚就是一個(gè)成功例子。又如測(cè)芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對(duì)硝基酚為底物，其分解產(chǎn)物的吸收峰由原來(lái)的278nm變?yōu)?18nm，Webb成功地在330nm進(jìn)行此酶監(jiān)測(cè)。
表17-2 一些氧化還原物質(zhì)的特性
| 物質(zhì) | 波長(zhǎng)（nm） | 克分子吸光度 | |
| 還原型 | 氧化型 | ||
| NAD，NADP | 340 | 6300 | 0 |
| FMN | 450 | 12200 | |
| FAD | 450 | 11300 | |
| 細(xì)胞色素C | 550 | 29500 | 8300 |
| 亞甲藍(lán)（等消光點(diǎn)） | 610 | 0 | 41000 |
| 二氫酚吲哚酚 | 600 | 0 | 21000 |
| 吩嗪甲酯硫酸 | 388 | 1500 | 22000 |
| 抗壞血酸 | 265 | 15100 | |
| 連二亞硫酸鹽 | 314 | 8000 | 0 |
| 氰化鐵（亞鐵） | 420 | 0 | 1020 |
分光光度法的上述原理還可以用于其它酶的測(cè)定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不飽和鍵，在330nm處有很強(qiáng)吸收峰，而酶作用產(chǎn)物無(wú)此不飽和鍵。則不難在330nm處對(duì)這些酶進(jìn)行直接測(cè)定。
此后在分光光度法的發(fā)展過程中又導(dǎo)入了酶偶聯(lián)技術(shù)。使得分光光度法幾乎能測(cè)定所有的酶。因此臨床實(shí)驗(yàn)室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術(shù)，不了解各種影響因素，要作好酶的測(cè)定是很困難的。
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