臨床生物化學(xué)/核酸擴(kuò)增技術(shù)

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臨床生物化學(xué)

診斷分子生物學(xué)基本技術(shù)
- 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)
  - 核酸雜交技術(shù)
  - 核酸擴(kuò)增技術(shù)
  - 核酸限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析
  - 核酸一級結(jié)構(gòu)（核苷酸序列sequence）分析

通過大腸埃希菌繁殖而增殖重組質(zhì)粒，也是擴(kuò)增核酸的手段。但在試管中有效擴(kuò)增DNA的方法，是在90年代才開展起來的多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）新技術(shù)。由于PCR靈敏度高、特異性好、操作方便，在我國發(fā)展很快。目前，PCR技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)雜交技術(shù)等）開發(fā)了許多PCR新技術(shù)（reverse transcriptase PCR；PCR-single strandconformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；熱啟動PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于點(diǎn)突變分析；二次PCR特異性好，靈敏度高；熱啟動PCR可提高特異性。

PCR技術(shù)原理是在了解DNA一級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可識別并結(jié)合引物，以單鏈DNA為模板，dNTP為底物，合成其互補(bǔ)鏈。通過反復(fù)變性，反復(fù)合成互補(bǔ)鏈的過程，達(dá)到DNA擴(kuò)增的目的。人的DNA擴(kuò)增引物長度多為20個核甘酸。（圖18-7）

PCR技術(shù)原理

圖18-7　PCR技術(shù)原理

PCR反應(yīng)：DNA樣品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，gelatin（明膠）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，礦物油一滴。93℃7分鐘→50-55℃2分鐘→70-72℃3-1.5分鐘→93℃2分鐘。

將反應(yīng)物和Marker點(diǎn)樣于凝膠一起電泳，紫外光下觀察結(jié)果，拍照保存結(jié)果。反應(yīng)物也可用于印跡（雜交）實(shí)驗(yàn)、多態(tài)分析、探針制備等。

注意事項(xiàng)：①DNA樣品純度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②設(shè)計(jì)的引物分子內(nèi)（特別3′端）和引物，1，2分子間不形成雙鏈。選擇性好，不增幅目的DNA以外區(qū)域的DNA。引物的G+C含量為40％-60％。③dNTP濃度過高易使Taq酶合成錯誤，一般在200μmol/L，有人建議40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L對酶有抑制作用。Mg²⁺濃度過高，NDA不易變性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶從嗜熱菌分離得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐熱每經(jīng)過一次熱變性要補(bǔ)加一次酶），現(xiàn)在經(jīng)基因克隆的重組體產(chǎn)物Taq酶最適pH8.3～8.8（室溫8.3-8.4），反應(yīng)溫度75-80℃，95℃以上失活明顯。無3′→5′校讀活性，對SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐溫－20可抵制SDS抑制）。該酶有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。⑥退火溫度一般設(shè)定為Tm－5℃，但實(shí)際上與引物一級結(jié)構(gòu)序列有關(guān)，設(shè)計(jì)不當(dāng)可造成非特異性退火，而造成非特異擴(kuò)增，此時應(yīng)調(diào)整溫度和相應(yīng)的時間。⑦循環(huán)次數(shù)受到的影響因素較多，增加次數(shù)可提高靈敏度，但易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。⑧PCR靈敏高，被檢樣品極易被污染，樣品純化，擴(kuò)增，檢測區(qū)域應(yīng)分開。房間應(yīng)經(jīng)常用紫外光照射。擴(kuò)增物應(yīng)定點(diǎn)丟棄，處理。